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简述细胞培养一般方法及注意事项
参考答案和解析
1.动物细胞培养基成分有哪些? ( 1 ) 氨基酸类 ( 2 ) 维生素类 ( 3 )大量元素 ---- 是调节培养液渗透压的主要成分。( 4 )微量元素 ----- 由血清提供的,在低血清或无血清培养液中,则需添加铁、铜、锌、硒等微量元素。( 5 )葡萄糖 ---- 能量来源之一,也是某些氨基酸合成的原料。( 6 )有机类( 7 )激素类 ---- 血清中含有许多激素。( 8 )生长因子类 2.血清的主要用途及注意事项? ( 1 )维持体外细胞生长;( 2 )提供细胞生存、生长和增值所必需的激素和生长因子;( 3 )补充基础培养液中没有或量不足的营养成分;( 4 )含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面粘附和铺展的生长基质成分;( 5 )还能为细胞提供载体蛋白,补充细胞外基质;( 6 )血清中还含有糠蛋白酶成分,起到中和作用;( 7 )为培养液提供良好的缓冲坏境;( 8 )血清还有一定的黏度,可以保护细胞免受机械损伤。 3.细胞培养的作用意义? ( 1 )有害物质的快速检测;( 2 )大面积皮肤烧伤的修复;( 3 )遗传病的产前诊断;( 4 )建立各种医学模型;( 5 )大量生产生物活性物质;( 6 )细胞与细胞之间的相互作用;( 7 )细胞内部与细胞外界之间的作用;( 8 )细胞内胞质的活动;( 9 )胞质与核质之间的流动 4.每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期?各期细胞有何特点? 每代细胞从开始接种到分离再培养,一般要经过以下阶段:潜伏期、指数 ( 对数 ) 生长期和停止期 ( 平台期 ) 。 1细胞接种培养初期,历经悬浮、贴壁及生长加速的阶段。细胞接种培养后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩,胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上,称贴壁,贴壁出现标志悬浮期结束。细胞贴附于支持物后,会发生一系列变化,然后还要经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时,可有生长活动,基本无增殖,少见分裂相。潜伏期后,细胞分裂出现,并逐渐增多,标志细胞进入指数生长期。 2又称对数期。此时细胞生长增殖旺盛,细胞成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究。细胞分裂相增多。(细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。) 3在细胞数量达饱和密度后,细胞停止增殖,进入停止期。此时细胞数量持平,故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,可继续存活一段时间。该时期细胞形态轮廓增强,最后开始衰退死亡。 5.动物细胞培养基有哪几种?无血清培养基成分有哪些? 平衡盐溶液、天然培养基、合成培养基、无血清培养液(由基础培养液和附加成分组成。 取代血清的补充物: 1 )激素和生长因子; 2 )结合蛋白类; 3 )低分子量营养因子; 4 )贴壁和铺展因子等。 6. 体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种 ? 按细胞在体外生长的形态特征 , 可分为哪几种常见类型 ? (1) 按生长方式分为二型: 粘附型细胞 : 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞 : 不必附着于固相支持物表面,而在悬浮状态下即可生长的细胞。(绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。) (2) 可分 四 型: (1) 上皮型细胞 (2) 成纤维型细胞 (3) 游走型细胞 (4) 多形型细胞 7. 简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程? (1) 通常,体外培养细胞的全部生命期 大致 可被分为 以下三个阶段: 1 原代培养期 : 也称初代培养, 是指 从 机体中 取出 细胞 接种培养到第一次传代 之前的这一阶段 。此期 的 细胞呈 现出 活跃移动 的特点 ,可见细胞分裂,但不旺盛。 处于原代 培养 阶段的 细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上 有很大的相似性 。细胞群 具有明显的异质性, 细胞 间的 相互依存性强 , 在软琼脂培养基 培养时 细胞 集落 形成率很低 。 2 .传代期 : 通常是培养细胞 全生命期中持续时间最长 的时期,原 代培养 的 细胞经传代后 常被 称做细胞系。一般情况下 ,正常体细胞在 传代 10 - 50 次左右 后 ,细胞 分裂的能力就会逐渐减弱 , 甚至完全丧失 ,细胞 便 进入 衰退期。 3 衰退期 : 处于衰退期的培养细胞, 增殖 速率已经变得 很慢或不 再 增殖 ,直至 最后衰退 死 亡。 以上 特点,主要是针对体外培养的机体正常细胞,对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言, 永生性或恶 型 性 的获得使得这类 细胞获 得 持久性 的 增殖能力,这样的细胞群体 常被 称 为 无限细胞系 或 连续细胞系。 (2) 每代贴附生长细胞的生长过程: 1 游离期:细胞接种后在培养液中呈悬浮状态,也称悬浮期。此时细胞质回缩,胞体呈圆球形。时间: 10 分钟一 4 小时 2 贴壁期:细胞附着于底物上,游离期结束。底物:玻璃、塑料、胶原、其它细胞等 3 潜伏期 : 此时细胞有生长活动,而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为 6 ~ 24 小时。 4 对数生长期:细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究。 5 停止期(平台期):细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂 机制:接触抑制、密度限制 8.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求? (1) 细胞的营养需要: 1 基本营养物质: 氨基酸(12种+谷氨酰胺) 、 维生素 、葡萄糖、核糖、脱氧核糖等 无机离子 。 2 促细胞生长因子:多由血清提供 (2) 细胞的生存环境: 1 温度条件对细胞生长的影响:不同生物来源的组织细胞培养温度不同;体外培养动物细胞最常用的温度是 37 °C , 耐低温不耐高温 。 在生理温度范围内,温度与细胞生长率之间存在正相关关系。 2 气相环境对细胞生长的影响:动物细胞培养的气相环境都是采用 5%CO2 与 95% 空气(提供氧)的混合气体。O 2 参与细胞的能量代谢过程 , CO 2 用于维持培养液的酸碱度, 一般多为开放式培养 3 培养液的酸碱度对细胞生长的影响:大多数的有机体细胞能在 pH6.0 ~ 8.0 的环境中生存。最适宜的 pH 值范围是 7.2 ~ 7.4 。体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力 4 无污染、无毒 。 9.细胞培养中最常用的抗生素及使用浓度是什么 ? 青霉素(常用浓度是 100u/ml )与链霉素( 100 μ g/ml )。 10.什么是原代培养?简述原代培养方法的分类及主要操作步骤? (1) 原代培养 : 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称原代培养。 (2) 原代培养方法分类:贴块法和消化法。消化法又分为冷消化与热消化;一次性消化与分次消化。 主要步骤: 贴块法:将取得洗净并剔去多余成分的组织切成约 1mm3 大小的植块,用于植块培养。 消化法:将取得洗净并剔去多余成分的组织 剪碎——蛋白酶溶液消化——机械方吹打组织块— 对滤过液离心( <1000r/m in, <10min ) ——用培养液悬浮成细胞悬液——计数并调节细胞密度——用于分离细胞培养
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